Кинетика ингибирования ферментативных реакций. Зависимость скорости ферментативных реакций от концентрации субстрата, среды и температуры
КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
Vфр определяется количеством вещества, которое превращается в единицу времени. V этих реакций зависит от влияния внешних факторов (температура, рН, воздействие природных и чужеродных соединений и т.д.).
Vфр является мерой каталитической активности и обозначается просто как активность ферментов.
Измерить активность ферментов можно только косвенно:
1) по количеству превращаемого S;
2) нарастанию концентрации Р в единицу времени.
Для выражения концентрации фермента пользуются:
а) единица измерения ферментов – это то количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля S в мин. [мкмоль/мин];
б) 1 катал (кат) – количество ферментов, способное вызывать превращение 1 моля S в Р в 1 сек. [моль/с].
1 кат = 6×107Е; 1Е = 16,67 (н кат)
Для выражения активности ферментов пользуются:
а) удельная активность ферментов – это число ферментов на 1 мг или число кат. на 1 кг белка;
б) молекулярная активность или число оборотов – это число молекул S, подвергающихся превращению одной молекулой Е в 1 мин.
Одна молекула каталазы эритроцитов расщепляет в 1 мин 5×106 молекул Н2О2.
Специфичность действия ферментов
Понятие Е S комплекса и АЦФ тесно взаимосвязаны с особым свойством ферментов – их специфичностью. По степени специфичности (в порядке ее снижения) различают:
I. Стереохимическую субстратную специфичность – в этом случае ферменты катализируют только 1 форму S (1 изомер). Например, фумаратгидратаза катализирует только превращение фумаровой кислоты, но не катализирует превращение ее изомера – малеиновую кислоту.
II. Абсолютную субстратную специфичность – Е превращает только 1S. Например, уреаза превращает только мочевину.
III. Абсолютная групповая S-ную специфичность. Ферменты действуют на группу сходных S-в. Например, алкоголь ДГ превращает не только этанол, но и другие алифатические спирты.
IV. Относительную групповую S-ную специфичность. Фермент воздействует не на группу молекул S, а на определенные связи определенных групп S-в. Например, пепсин и трипсин специфичны по отношению к пептидным связям в различных белках.
V. Относительную S-ную специфичность. Фермент катализирует, превращаясь в S-в, относящимся к различным группам химических соединений. Например, фермент цитохром-450 катализирует реакции гидроксилирования до 7000 разных S-в. Это наименее специфичная ферментная система.
Существует две теории объяснения специфичности ферментов.
Гипотеза Э. Фишера – гипотеза «ключа и замка» или гипотеза «шаблона». По Фишеру, фермент – это жесткая структура, АЦФ которого - точный «слепок» S-та. Если S подходит к Е как ключ к замку, то реакция произойдет. Если же S немного изменен («ключ»), то он не соответствует АЦФ («замку»), и реакция становится невозможной. Несмотря на логичность такого объяснения, гипотеза Фишера не объясняет, на чем тогда основаны абсолютная и относительная групповая специфичность. Например, цитохром-450 соединяется с таким большим количеством S-в, различных по строению.
Эти внешние противоречия объясняет гипотеза Кошленда, или гипотеза вынужденного соответствия. По мнению Кошленда, молекула фермента не «жесткая», а гибкая структура и конфигурация фермента и его АЦФ начинают изменяться в момент присоединения фермента к S или другим лигандам. При образовании Е-S комплекса кроме геометрической комплементарности имеет место и электростатическая, которая осуществляется благодаря спариванию противоположно заряженных молекул Е и S. В действительности, видимо, имеют место оба варианта присоединения.
Гипотеза Кошленда позволяет объяснить, почему происходит превращение близких аналогов S-в. Если «ложный» субстрат (квази-S) отличается от природного и АЦФ принимает конформацию близкую к истинному субстрату, то расстановка каталитических групп в таком Е-S комплексе позволит осуществить реакцию. Этот «обман» фермент как бы не замечает, хотя реакция идет и не так быстро, как с истинным субстратом. Если конфигурация квази субстрата не позволяет правильно расположиться каталитической группе, то в этом случае реакция не пойдет. Т.е. если диапазон конформационных перестроек ограничен до одной единственно возможной, то фермент высокоспецифичен, а если возможности перестройки АЦФ велики, то фермент срабатывает и на квази субстраты.
Зависимость Vфр от рН-среды
Для каждого фермента имеется свой оптимум рН, при котором Vфр максимальна. Отклонение рН в ту или другую сторону ведет к снижению активности фермента. Большая часть ферментов имеет рН~7,0 то есть он совпадает с физиологическими значениями рН.
При оптимальном значении рН функциональные группы АЦФ и сам S находятся в наиболее предпочтительной для связи форме. Некоторые ферменты имеют оптимальную рН, резко отличающиеся от физиологических значений, пепсин на 100% активен при рН = 1,5-2,5; аргиназа – при рН = 10.
Зависимость Vфр от температуры
С повышением температуры среды Vфр увеличивается, достигает оптимальных величин ~ 20-40ºС для большинства ферментов.
Термолабильность ферментов связана с их белковым строением: при повышении температуры до 40-50ºС и выше, происходит их денатурация.
Для некоторых ферментов денатурации наступает при 0ºС.
Для любых химических реакций при повышении температуры на каждые 10ºС V реакции увеличивается в 2-3 раза, для ферментативных реакций этот коэффициент ниже – 2 и даже меньше. Исключение: термостабильный фермент адениматциклаза выдерживает температуру 100ºС, а фермент каталаза активен при 0ºС.
Зависимость Vфр от конц. S.
Механизм действия ферментов описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Установить зависимость Vфр от [S] можно графически.
а) по кривой Михаэлиса: чем меньше Km, тем больше Vm и тем выше сродство E к S.
Vmax соответствует состоянию полного насыщения фермента S-том.
в растворе избыток Е (3 мол S, 5 мол Е) это участок насыщения фермента S-том.
б) методом обратных величин Лайнцивера-Берка, где зависимостьVфр от [S] рассчитывают в обратных величинах.
Регуляция активности ферментов.
Ферменты являются катализаторами с регулируемой активностью, поэтому через ферменты можно контролировать Vфр. Регуляция активности может осуществляться путем взаимодействия ферментов с различными биологическими компонентами или же чужеродными соединениями (лекарствами, ядами), которые называются модификаторами. Если в присутствии модификатора Vфр возрастает, то такие модификаторы называют активаторами, а если падает ингибиторами.
Активирование ферментов.
Существует несколько видов активации ферментов.
1. Активирование путем воздействия на субъединицы молекул фермента. Некоторые ферменты имеют ЧС в виде 2-х субъединиц: каталитической и регуляторной. При сохранении ЧС АЦФ скрыт.
Например, многие ферменты в организме вырабатываются в виде проферментов или зимогенов, то есть в неактивном состоянии. По мере необходимости определенное их количество активируется. Например, неактивный трипсиноген под действием фермента энтерокиназы превращается в активный трипсин.
2. На активирование ферментов влияют ионы:
а) катионы – их воздействие более специфично, чем анионов. Катионы могут сами выступать в виде простетических групп в ферментах (Fe в цитохроме) или своим присутствием воздействовать на фермент, активируя его. Например, угольная ангидраза активируется в присутствии Zn+2.
б) анионы – действуют менее специфично и обычно виляют на 2-й этап ф.р. – распад ES-комплекса. Однако иногда и анионы являются непосредственными активаторами ферментов. Например, Cl– активирует неактивный пепсиноген и превращает его в активный пепсин.
3. Активация путем защиты ферментов от инактивирующего влияния различных воздействий. Обеспечивается специфическими веществами, предупреждающими отрицательное влияние на ферменты.
Ингибирование ферментов.
Вещества, вызывающие частичное или полное торможение ферментов называются ингибиторами(I). Ингибиторы обладают свойством прочно связываться с ферментом. По этому признаку различают ингибирование: обратимое и необратимое.
При обратимом ингибировании I и Е вступают во взаимодействием. Если каким-нибудь образом ингибитор нейтрализовать (например, диализом), то активность Е восстанавливается. Если этого не удается достигнуть, то речь идет о необратимом ингибировании.
Обратимое ингибирование
конкурентное неконкурентное
Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами со структурой, сходной со структурой истинного S.
I и S конкурируют за АЦФ, комплекс с ферментом образует то соединение, молекул которого больше. С ферментом связывается либо I, либо S, для такого ингибирования справедливо уравнение: .
НИКОГДА при конкурентном ингибировании не образуется тройной комплекс E S I, чем этот вид ингибирования отличается от других.
Например, сукцинат ДГ входит в состав ферм. системы ЦТК. Его природный S – сукцинат. Ингибиторами могут быть оксалоацетат, малонат (квази-субстраты).
При избытке ингибитор связывается поляризованными группами с АЦФ сукцинат ДГ.
При конкурентном ингибировании Vmax никогда не меняется, но меняется Km. Наклон кривых в присутствии I увеличивается, в результате Km увеличивается
По результатам эксперимента по кривой Михаэлиса-Ментен можно установить конкурентную природу I (по увеличению Km и стабильности Vmax). Характер этой кривой свидетельствует и об обратимости процесса, то есть увеличивая [S], можно сократить время достижения Vmax.
Метод конкурентного ингибирования нашел широкое применение в медицинской практике.
Пара-аминобензойная кислота и сульфаниламид имеют сходную структуру. п-АБК-ту бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составляющей частью ферментов бактерий. С/а блокирует действие ферментов, синтезирующих фолиевую кислоту, в результате рост бактерий останавливается.
Неконкурентное ингибирование – это обратимое торможение, когда I взаимодействует не с АЦФ, а с другими функциональными группами ферментов, то есть в данном случае I не имеет структурного сходства с S. Присоединение такого ингибитора снижает активность фермента, а не его сродство к S, то есть ингибитор не изменяет Km, а снижает макс. Vфр.
При этом виде ингибирования образуется неактивные малодиссоциирующие комплексы E I или E I S. Например, действие HCN, других химических соединений, связывающих ионы Ме или других функциональных групп в молекуле фермента.
Смешанное ингибирование (или частично неконкурентный тип) - снижение Vmax сочетается с увеличением Km.
При этом образуется Е I S-комплекс, а S в нем подвергается медленному каталитическому превращению.
Субстратное ингибирование – это снижение Vфр при значительном повышении [S]. Первоначально, с увеличением [S] Vфр растет, достигая своего максимума, но при дальнейшем увеличении [S] Vфр начинает падать.
Механизм ингибирующего действия избытка S разнообразен. Чаще всего это взаимодействие промежуточных соединений E S с еще одной иди несколькими молекулами S, в результате чего образуется неактивное соединение, то
есть комплекс, не дающий продуктов реакции.
Методы регуляции активности ферментов
В живом организме одновременно происходят реакции синтеза, распада и взаимопревращений тысяч разнообразных веществ. Все эти множества реакций регулируются в организме посредством различных механизмов, наиболее важными из которых являются:
а) регуляция по типу обратной связи; характерна обычно для реакций синтеза. Накопление продуктов реакции свыше допустимого уровня оказывает сильное ингибирующее действие на первую стадию процесса:
б) аллостерическая регуляция активности ферментов – характерна только для особой группы ферментов с ЧС, имеющих регуляторные центры для связывания аллостерических эффекторов. Отрицательные эффекторы тормозят превращение S и выступают в роли аллостерических ингибиторов. Положительные эффекторы, напротив, ускоряют Vфр, поэтому их относят к к аллостерическим активаторам.
Механизм действия аллостерических ингибиторов на фермент заключается в изменении АЦФ этого фермента. Уменьшение Vфр является либо следствием увеличения Km, либо результатом уменьшенияVmax, при тех же насыщающих концентрациях S. Аллостерические активаторы напротив облегчают превращение S в АЦФ, что сопровождается либо уменьшением Km, либо увеличением Vmax.
Компартментализация – явление, при котором с помощью мембран пространственно разъединяется
а) фермент от своих S (например, лизомальные ферменты от веществ, на которые они действуют в цитоплазме);
б) взаимно несовместимые в одно и тоже время процессы. Синтез жк происходит в растворимой части цитоплазмы, а распад жк – в митохондриях.
§ 12. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
Кинетика ферментативных реакций – наука о скоростях ферментативных реакций, их зависимости от различных факторов. Скорость ферментативной реакции определяется химическим количеством прореагировавшего субстрата или образовавшегося продукта реакции в единицу времени в единице объема при определенных условиях:
где v – скорость ферментативной реакции, – изменение концентрации субстрата или продукта реакции, t – время.
Скорость ферментативной реакции зависит от природы фермента, которая определяет его активность. Чем выше активность фермента, тем выше скорость реакции. Активность фермента определяют по скорости реакции, катализируемой ферментом. Мерой активности фермента является одна стандартная единица активности фермента. Одна стандартная единица активности фермента – это такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 минуту.
В процессе ферментативной реакции фермент (Е) взаимодействует с субстратом (S), в результате образуется фермент-субстратный комплекс, который затем распадается с высвобождением фермента и продукта (Р) реакции:
Скорость ферментативной реакции зависит от многих факторов: от концентрации субстрата и фермента, температуры, рН среды, наличия различных регуляторных веществ, способных увеличивать или снижать активность ферментов.
Интересно знать! Ферменты используются в медицине для диагностики различных заболеваний. При инфаркте миокарда вследствие повреждения и распада сердечной мышцы в крови резко возрастает содержание ферментов аспартаттрансаминазы и аланинаминотрансферазы. Выявление их активности позволяет диагностировать данное заболевание.
Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции
Рассмотрим влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции (рис. 30.). При низких концентрациях субстрата скорость прямо пропорциональна его концентрации, далее с ростом концентрации скорость реакции увеличивается медленнее, а при очень высоких концентрациях субстрата скорость практически не зависит от его концентрации и достигает своего максимального значения (V max). При таких концентрациях субстрата все молекулы фермента находятся в составе фермент-субстратного комплекса, и достигается полное насыщение активных центров фермента, именно поэтому скорость реакции в этом случае практически не зависит от концентрации субстрата.
Рис. 30. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата
График зависимости активности фермента от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса – Ментен, которое получило свое название в честь выдающихся ученых Л.Михаэлиса и М.Ментен, внесших большой вклад в исследование кинетики ферментативных реакций,
где v – скорость ферментативной реакции; [S] – концентрация субстрата; K M – константа Михаэлиса.
Рассмотрим физический смысл константы Михаэлиса. При условии, что v = ½ V max , получаем K M = [S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.
Скорость ферментативной реакции зависит и от концентрации фермента (рис. 31). Эта зависимость носит прямолинейный характер.
Рис. 31. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента
Влияние температуры на скорость ферментативной реакции
Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры представлена на рис. 32.
Рис. 32. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.
При низких температурах (приблизительно до 40 – 50 о С) повышение температуры на каждые 10 о С в соответствии с правилом Вант-Гоффа сопровождается увеличением скорости химической реакции в 2 – 4 раза. При высоких температурах более 55 – 60 о С активность фермента резко снижается из-за его тепловой денатурации, и, как следствие этого, наблюдается резкое снижение скорости ферментативной реакции. Максимальная активность ферментов наблюдается обычно в пределах 40 – 60 о С. Температура, при которой активность фермента максимальна, называется температурным оптимумом. Температурный оптимум ферментов термофильных микроорганизмов находится в области более высоких температур.
Влияние рН на скорость ферментативной реакции
График зависимости ферментативной активности от рН представлен на рис. 33.
Рис. 33. Влияние рН на скорость ферментативной реакции
График зависимости от рН имеет колоколообразную форму. Значение рН, при котором активность фермента максимальна, называется рН-оптимумом фермента. Значения рН-оптимума для различных ферментов колеблются в широких пределах.
Характер зависимости ферментативной реакции от рН определяется тем, что этот показатель оказывает влияние на:
a) ионизацию аминокислотных остатков, участвующих в катализе,
b) ионизацию субстрата,
c) конформацию фермента и его активного центра.
Ингибирование ферментов
Скорость ферментативной реакции может быть снижена действием ряда химических веществ, называемых ингибиторами . Некоторые ингибиторы являются для человека ядами, например, цианиды, другие – используются в качестве лекарственных препаратов.
Ингибиторы можно разделить на два основных типа: необратимые и обратимые . Необратимые ингибиторы (I) связываются с ферментом с образованием комплекса, диссоциация которого с восстановлением активности фермента невозможна:
Примером необратимого ингибитора является диизопропилфторфосфат (ДФФ). ДФФ ингибирует фермент ацетилхолинэстеразу, играющего важную роль в передаче нервного импульса. Этот ингибитор взаимодействует с серином активного центра фермента, блокируя тем самым активность последнего. Вследствие этого нарушается способность отростков нервных клеток нейронов проводить нервный импульс. ДФФ является одним из первых веществ нервно-паралитического действия. На его основе создан ряд относительно нетоксичных для человека и животных инсектицидов - веществ, ядовитых для насекомых.
Обратимые ингибиторы, в отличие от необратимых, при определенных условиях могут быть легко отделены от фермента. Активность последнего при этом восстанавливается:
Среди обратимых ингибиторов выделяют конкурентные и неконкурентные ингибиторы.
Конкурентный ингибитор, являясь структурным аналогом субстрата, взаимодействует с активным центром фермента и таким образом перекрывает доступ субстрата к ферменту. При этом ингибитор не подвергается химическим превращениям и связывается с ферментом обратимо. После диссоциации комплекса EI фермент может связаться либо с субстратом и преобразовать его, либо с ингибитором (рис. 34.). Поскольку и субстрат и ингибитор конкурируют за место в активном центре, такое ингибирование называется конкурентным.
Рис. 34. Механизм действия конкурентного ингибитора.
Конкурентные ингибиторы используются в медицине. Для борьбы с инфекционными болезнями ранее широко применялись сульфаниламидные препараты. Они близки по своей структуре к пара-аминобензойной кислоте (ПАБК), необходимому фактору роста многих патогенных бактерий. ПАБК является предшественником фолиевой кислоты, которая служит кофактором ряда ферментов. Сульфаниламидные препараты выступают в качестве конкурентного ингибитора ферментов синтеза фолиевой кислоты из ПАБК и тем самым подавляют рост и размножение патогенных бактерий.
Неконкурентные ингибиторы по структуре не сходны с субстратом и при образовании EI взаимодействуют не с активным центром, а с другим участком фермента. Взаимодействие ингибитора с ферментом приводит к изменению структуры последнего. Образование EI-комплекса является обратимым, поэтому после его распада фермент вновь способен атаковать субстрат (рис. 35).
Рис. 35. Механизм действия неконкурентного ингибитора
В качестве неконкурентного ингибитора может выступать цианид CN - . Он связывается с ионами металлов, входящими в состав простетических групп и подавляет активность этих ферментов. Отравления цианидами крайне опасны. Они могут привести к летальному исходу.
Аллостерические ферменты
Термин «аллостерический» происходит от греческих слов allo – другой, stereo – участок. Таким образом, аллостерические ферменты наряду с активным центром имеют другой центр, называемый аллостерический центр (рис. 36). С аллостерическим центром связываются вещества, способные изменять активность ферментов, эти вещества называют аллостерическими эффекторами . Эффекторы бывают положительными – активирующими фермент, и отрицательными – ингибирующими, т.е. снижающими активность фермента. Некоторые аллостерические ферменты могут подвергаться действию двух и более эффекторов.
Рис. 36. Структура аллостерического фермента.
Регуляция мультиферментных систем
Некоторые ферменты действуют согласованно, объединяясь в мультиферментные системы, в которых каждый фермент катализирует определенную стадию метаболитического пути:
В мультиферментной системе есть фермент, который определяет скорость всей последовательности реакций. Этот фермент, как правило, бывает аллостерическим и находится в начале матаболитического пути. Он способен, получая различные сигналы, как повышать, так и понижать скорость катализируемой реакции, тем самым регулируя скорость всего процесса.
Скорость ферментативных реакций зависит от концентрации фермента, субстрата, температуры, рН, наличия активаторов и ингибиторов.
В условиях избытка субстрата скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента (рис. 3.2).
Рис. 3.2. Зависимость скорости реакции от концентрации фермента.
Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата представлена на рисунке 3.3.
Рис. 3.3. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата.
На графике выделяют 3 участка. При низкой концентрации субстрата (участок а ) скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата и подчиняется кинетике первого порядка. На участке b (реакция смешанного порядка) эта зависимость нарушается. На участке c скорость реакции максимальна и не зависит от концентрации субстрата.
Ферментативная реакция характеризуется формированием фермент-субстратного комплекса , который распадается с образованием свободного фермента и продукта реакции.
В этом уравнении k 1 – константа скорости образования фермент-субстратного комплекса, k 2 – константа диссоциации фермент-субстратного комплекса с образованием свободного фермента и субстрата и k 3 – константа скорости диссоциации фермент-субстратного комплекса до свободного фермента и продукта реакции.
Михаэлис и Ментен предложили уравнение, которое описывает зависимость скорости реакции от концентрации субстрата.
v – скорость реакции при данной концентрации субстрата; Ks – константа диссоциации фермент-субстратного комплекса; Vmax – максимальная скорость реакции.
Ks=k -2 /k 1 т.е. отношение константы обратной реакции к константе прямой реакции.
Однако данное уравнение описывает только участок а на графике и не учитывает влияния на скорость ферментативного процесса продуктов реакции.
Холдейн и Бриггс заменили в уравнении константу диссоциации на константу Михаэлиса (Кm).
Константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата , при которой скорость реакции равна половине максимальной. Константа Михаэлиса характеризует сродство фермента и субстрата. Высокое сродство фермента к субстрату характеризуется низкой величиной Кm и наоборот.
Использование графика, предложенного Михаэлисом и Ментен неудобно. Для более удобного графического представления Г.Лайнуивер и Д.Бэрк преобразовали уравнение Холдейна и Бриггса по методу двойных обратных величин, исходя из того принципа, что если существует равенство между двумя величинами, то и обратные величины также будут равны.
Графическое изображение зависимости скорости реакции от рН имеет колоколообразную форму. Значение рН, при котором фермент проявляет максимальную активность, называется оптимумом рН (рис. 5.4 А). Для большинства ферментов оптимум рН равен 6-8. Исключение составляет пепсин, оптимум которого равен 2,0. При изменении рН в ту или другую сторону от оптимума скорость реакции уменьшается, вследствие ионизации функциональных групп фермента и субстрата, что нарушает образование фермент-субстратного комплекса.
Рис. 3.4. Зависимость скорости реакции от рН (А) и температуры (Б).
Скорость химической реакции повышается в 2 раза при повышении температуры на 10°С. Однако вследствие белковой природы фермента при дальнейшем повышении температуры наступает денатурация фермента. Температура, при которой скорость реакции максимальна, называется температурным оптимумом (рис. 3.4. Б). Для большинства ферментов оптимум температуры составляет 37-40°С. Исключение составляет миокиназа мышц, которая выдерживает нагревание до 100°С.
Активаторы ферментов – это вещества 1) формирующие активный центр фермента (Co 2+ ,Mg 2+ , Zn 2+ , Fe 2+ , Са 2+); 2) облегчающие образование фермент-субстратного комплекса (Мg 2+); 3) восстанавливающие SH-группы (глутатион, цистеин, меркаптоэтанол); 4) стабилизирующие нативную структуру белка-фермента. Активируют ферментативные реакции обычно катионы (в таблице Менделеева с 19 по 30). Анионы менее активны, хотя ионы хлора и анионы некоторых других галогенов могут активировать пепсин, амилазу, аденилатциклазу. Активаторами могут быть белки: апопротеин А-I (ЛХАТ), апопротеин С-II (ЛПЛ).
Механизм действия активаторов:
1) участвуют в формировании активного центра ферментов;
2) облегчают связывание субстрата и фермента;
3) участвуют в формировании нативной структуры фермента.
Ингибиторы – вещества, вызывающие частичное или полное торможение реакций, катализируемых ферментами.
Ингибиторы классифицируются на неспецифические и специфические . Действие неспецифических ингибиторов не связано с механизмом действия ферментов. Эти ингибиторы вызывают денатурацию белка-фермента (нагревание, кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов и др.).
Специфические ингибиторы влияют на механизм действия ферментов. Специфические ингибиторы делятся на 2 группы: обратимые и необратимые . Необратимые ингибиторы вызывают стойкое необратимое изменение или модификацию функциональных групп фермента путем прочного или ковалентного связывания. К этой группе относятся: 1) ингибиторы металлосодержащих ферментов (HCN, RCN, HF, CO и др.). Эти соединения связываются с металлами с переменной валентностью (Cu или Fe), в результате чего нарушается процесс переноса электронов по дыхательной цепи ферментов. Поэтому эти ингибиторы называются дыхательными ядами. 2) ингибиторы ферментов, содержащих SH-группы (монойодацетат, дийодацетат, йодацетамид, соединения мышьяка и ртути). 3) ингибиторы ферментов, содержащих ОН-группу в активном центре (фосфороорганические соединения, инсектициды). Эти ингибиторы тормозят, прежде всего, активность холинэстеразы – фермента, играющего первостепенную роль в деятельности нервной системы.
Обратимое ингибирование поддается количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса-Ментен. Обратимые ингибиторы делятся на конкурентные и неконкурентные .
Конкурентные ингибиторы – это вещества по структуре похожие на субстрат. Ингибитор связывается с активным центром фермента и препятствует образованию фермент-субстратного комплекса.
Классическим примером конкурентного ингибирования является торможение сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой. Сукцинатдегидрогеназа катализирует окисление янтарной кислоты (сукцината) путем дегидрирования в фумаровую кислоту.
Если в среду добавить малоновую кислоту (ингибитор), то в результате структурного сходства с истинным субстратом сукцинатом он будет реагировать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса, однако реакция происходить не будет.
Действие ингибитора устраняется путем увеличения концентрации субстрата . При конкурентном ингибировании изменяется кинетика ферментативных реакций: увеличивается Кm, V max остается постоянной (рис. 3.5).
Рис. 3.5. Влияние конкурентных ингибиторов на скорость ферментативной реакции
Метод конкурентного ингибирования нашел применение в медицинской практике, в качестве антиметаболитов .
Например, для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты. Эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, необходимой для жизнедеятельности бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту.
Неконкурентные ингибиторы – вещества, не имеющие структурного сходства с субстратами. Неконкурентные ингибиторы связываются не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента, например, в аллостерическом центре. Это изменяет конформацию активного центра таким образом, что нарушается взаимодействие с ним субстрата.
При неконкурентном ингибировании: V max уменьшается, а K m не изменяется (рис. 3.6).
Основы кинетики ферментативных процессов были заложены в трудах Михаэлиса и Ментен, в частности в уравнении ферментосубстратного комплекса.
Во кинетикой ферментативных процессов понимают раздел науки о ферментах, изучающая зависимость скорости ферментативной реакции от химической природы субстрата, условий среды, а также посторонних факторов, которые влияют на ход реакции.
Когда концентрация субстрата достаточно велика, то она уже не влияет на скорость, ибо последняя стала максимальной (свидетельство того, что весь фермент связан с субстратом).
Исследование активности ферментов проводят при больших концентрациях субстратов (нулевой порядок реакции). В этих условиях все изменения скорости реакции будут зависеть только от количества фермента. Но в живых клетках концентрации субстрата, как правило, далеки от насыщения ферментов. Это означает, что ферменты в клетках используют не всю свою мощь.
Зависимость скорости ферментативной реакции от количества фермента
Если субстрат находится в избытке, что практически имеет место в экспериментальных условиях, то скорость реакции пропорциональна количеству фермента. Но, если количество фермента увеличить настолько, чтобы субстрат не является в избытке, то такая пропорциональность нарушится.
Скорость ферментативной реакции линейно возрастает с увеличением содержания фермента. Но чрезмерный рост концентрации фермента приводит к тому, что субстрата становится меньше, чем фермента и это проявляется уменьшением нарастания скорости реакции.
Воздействие на ферменты модуляторов
Активность ферментов может изменяться не только за изменением количества субстрата, фермента, рН среды, но и под влиянием различных химических веществ. Вещества, влияющие на ход ферментативных реакций, называются их модуляторами, или эффекторами. Они делятся на активаторы и ингибиторы, то есть под их влиянием реакция может ускоряться или замедляться. Изучение действия модуляторов ферментов имеет практическое значение, так как позволяет глубже понять природу действия ферментов. Некоторые из них играют роль естественных регуляторов метаболизма. Существует много типов модуляторов активности ферментов, отличающихся между собой по строению и механизму действия.
активаторы ферментов
Роль активаторов могут играть как органические (желчные кислоты, ферменты и др.), Так и неорганические вещества (ионы металлов, анионы). Нередко встречаются случаи, когда одна и та же вещество в отношении одного фермента является активатором, а в отношении другой – ингибитором. Ионы металлов бывают весьма специфическими активаторами для определенных ферментов. Они могут способствовать присоединению субстрата к ферменту, участвовать в формировании третичной структуры фермента или быть частью активного центра. Ионы многих металлов (натрия, калия, кальция, магния, железа, меди и др.) Являются обязательными компонентами, которые необходимы для нормального функционирования многих ферментов. Иногда для некоторых ферментов нужно несколько различных ионов. Например, для Na +, К + -АТФазы, осуществляющей транспорт ионов через плазматическую мембрану, необходимые для нормального функционирования ионы калия, натрия и магния.
Металлы могут входить в состав простетической группы ферментов. Например, железо в составе порфириновых соединений является необходимым компонентом ферментов цитохромной системы, каталазы и пероксидазы; кобальт входит в простетической группы гомоцистеинтрансметилазы и метилмалонилизомеразы ферментов; медь – до аскорбатоксидазы; марганец является активатором изоцитратдегидрогеназы.
Металлоферментов, содержащие в своем составе преимущественно двух- и трехвалентные ионы образуют с остатками функциональных групп аминокислот и соответствующими ионами клешневидные хелатные соединения. В таких соединениях ионы оказывают ферментам определенной пространственной структуры и способствуют образованию ферментосубстратних комплексов. Некоторые ферменты при отсутствии металлов просто не проявляют ферментативной действия. Например, карбоангидразы без цинка не имеет свойств фермента и действие цинка нельзя заменить никаким другим ионом.
Существует группа ферментов, активируются с помощью цАМФ. Такие ферменты называются протеинкиназы. Механизм их активации такой. Протеинкиназа состоит из двух субъединиц: каталитической, содержащий активный центр, и регуляторной, в которой расположен центр связывания цАМФ. Фермент неактивен, потому что его активный центр закрыт. Он освобождается только при взаимодействии ц-АМФ и регуляторного центра фермента.
Зависимость скорости реакции от концентрации фермента и концентрации субстрата (кинетика ферментативных реакций) представлена на графиках.
график 1 график 2
В ферментативной реакции (F+S 2 ó 1 FS→ 3 F + P) выделяют скорости трёх составляющих этапов:
1- образование фермент-субстратного комплекса FS,
2- обратный распад фермент – субстратного комплекса,
3 – распад фермент-субстратного комплекса с образованием продуктов реакции. Скорость каждой из этих реакций подчиняется закону действующих масс:
V 1 = К 1 [F]* [S]
V 2 = K 2 *
В момент равновесия скорость реакции образования FS равна сумме скоростей его распада: V 1 = V 2 +V 3 . Из трёх этапов ферментативной реакции наиболее важным и медленным является третий, так как он связан с образованием продуктов реакции. По приведенной выше формуле найти скорость V 3 невозможно, так как фермент- субстратный комплекс очень неустойчив измерение его концентрациизатруднено. В связи с этим, Михаэлис-Ментен ввели Кm – константу Михаэлиса и преобразовали уравнение для измерения V 3 в новое уравнение, в котором присутствуют реально измеримые величины:
V 3 = K 3 * * [S] / Km +[S] или V 3 =V max * [S] / Km+[S]
– исходная концентрация фермента
Кm – константа Михаэлиса.
Физический смысл Кm: Кm = (К 2 +К 3) /К 1 . Она показывает соотношение констант скоростей распада фермент-субстратного комплекса и константы скорости его образования.
Уравнение Михаэлиса-Ментен является универсальным. Оно иллюстрирует зависимость скорости реакции от от [S]
1. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата.
Эта зависимость выявляется при малых концентрациях субстрата [S]
2. Зависимость скорости от концентрации фермента проявляется при высокой концентрации субстрата. S≥Km. В этом случае можно пренебречь Km и уравнение преобразуется в следующее: V 3 = K 3* (( * [S]) /[S]) =K 3* = V max . Таким образом, при высокой концентрации субстрата скорость реакции определяется концентрацией фермента и достигает максимального значения V 3 = K 3 =V max . (третий участок графика 2).
3. Позволяет определить численное значение Km при условии V 3 = V max /2. В этом случае уравнение приобретает вид:
V max /2 = ((V max *[S])/Km+[S]), откуда следует, что Km=[S]
Таким образом, Кm численно равна концентрации субстрата при скорости реакции, равной половине максимальной. Кm является очень важной характеристикой фермента, она измеряется в молях (10 -2 – 10 -6 моль) и характеризуют специфичность фермента: чем ниже Km, тем выше специфичность фермента.
Графическое определение константы Михаэлиса.
Удобнее использовать график, представляющий прямую линию. Такой график предложен Лайнуивером – Берком (график двойных обратных величин), который соответствует обратному уравнению Михаэлиса - Ментен